Полученные в процессе клинических исследований зубной пасты R . O . C . S . данные о значительном улучшении гигиенического состоянии полости рта, отмеченная и исследователями и испытуемыми задержка скорости отложения зубного налета [1, 2] побудили нас к проведению дополнительных исследований влияния протеолитического фермента бромелаина (одного из ключевых компонентов запатентованного состава) на антиадгезивные свойства зубной пасты Установление взаимодействия между патогенноми клеткой-мишенью в результате бактериальной адгезии является определяющим звеном в ходе инфекционного про­ цесса. Прикрепление и последующее размножение микроорга­низмов с образованием микроколоний и/или пленки обеспечи­ вает им более выгодные условия существования, связанные, в частности, с противодействием механическому удалению бак­ терий из макроорганизма. Доказано, что адгезивность болезне­ творных микроорганизмов часто коррелирует с их патоген ностью и вирулентностью. Так, на авиру лентном штамме Escherichia coli , было продемонстрировано, что перенесенная плазмида, контролирующая синтез антигена К88, усиливает не только адгезию микроорганизмов к щеточной каемке энтероцитов , но и вирулентность экспериментально изменен­ ного штамма [3, 4, 5]. А дгезия E . Coli к уроэпителию приводит не только к механическому закреплению микроорганизма в новой экологической нише, но и вызывает адекватную новым условиям перестройку метаболизма. Кроме перестройки метаболизма, механический контакт и связывание Р-ворсинок с клеткой эпителия ведут к изменению механизма сборки новых ворсинок (они становятся короче) и являются сигналом к экспрессии ряда генов вирулентностиE.coli(комплексарари гемолизина) [6]. Молекулярный механизм бактериальной адгезии являетсяуниверсальным для патогенных и комменсальных форм, чтоподтверждено на примере микрофлоры верхних дыхательных путей, нижних отделов пищеварительного и мочеполового трак тов [7]. Основой взаимодействия любых биоло­ гических систем и межклеточных коммуникаций служит лиганд- рецепторное узнавание [8, 9] , при котором меньший по размерам и молекулярноймассе участник называют лигандом (например, поверхностные структуры клеточной стенки бактерий), а его более крупныйкомплементарный партнер — рецептором (например, сайты свя­ зывания на цитолемме эукариотической клетки). Лиганды и рецепторы представляют собой полимеры гликолипидной или гликопротеинной природы, состоящие из множе­ственных копий уникальных в каждом случае субъединиц и определяющие тропизм различных патогенов к своим клеткам-мишеням [10]. Именнопоследнее обстоятельство способствует колонизации бакте­ риями тканей макроорганизма с повышенной плотностью ре­цепторов [9]. In vivo на процесс адгезии существенное влияние оказывают растворенные компонентыбиологических жидкостей и секретов, с которыми патогены чаще встречаются до контактов с клетками-мишенями и кото­ рые по химическому строению аналогичны клеточным рецепто­ рам. Orksov a . Birch - Anderson (1980) [11] продемонстрировали, что Е. coli адгезируют к муцину слюны раньше, чем к эпителию ротовой полости. Способностью адсорбировать белковые компоненты слюны обладают стрептококки полости рта (Streptococcus sanguis, S. Mitis, S. Salivarius), причем в исследовании было показано, что нарушить эту адгезию возможно с помощью протеолитического фермента трипсина [12]. Показатели адгезии как многофакторного процесса зависятот большого числа условий, как со стороны бактерий, так и макроорганизма. Известно, что видовая принадлежность в значительной степени характеризует адгезивные свойства бактерий. Так, Streptococcus mutans практически не фикси­ руется на эпителиоцитах языка и щек, но необратимо прикреп­ ляется к поверхности зубов [13]. Arbuth ­ nott a . Smith (1979)[5] отмечают, что адгезивность St . pyogenes к эпителиальным клеткам ротовой полости в 6 раз выше, чем у Е. coli . Для це­ лого ряда микроорганизмов показана прямая связь степени гидрофобности клеточной поверхности и адгезивности. Так, St . aureus из гнойных очагов более гидрофобен, чем из окру­ жающей среды, полости носа, поверхности кожи [4] . К факторам, влияющим на адгезивные свойства тканей и клеток хозяина, относится индивидуальное состояние пациен­ та: высокая степень колонизации эпителиоцитов ротовой по­ лости Str . pyogenes у больных различными воспалительными заболеваниями, снижение этого показателя у носителей и прак­ тически полное отсутствие у здоровых людей [4].Существует разница в прикреплении микроорганизмов к раз­ ным участкам в пределах одного макроорганизма. Для Str . sa livarus и St . aureus нижняя поверхность языка рассматри­ вается как богатая рецепторами зона и наиболее благоприятная для инвазии область [13]. На вариабельность рецепторного аппарата эпителиоцитов может оказы вать влияние и гетерогенность клеточной популяции, обусловленная физиологическими изменениями поверхностных структур клеток при дифференциации или старении. Патологическиеизменения тканей макроорганизма создают дополнительные условия, способствующие адгезии микроорганизмов [14] . Изучение молекулярной природы лиганд-рецепторных комплексов, образующихся при взаимодействии различных бактерий с соответствующими им клетками-мишенями, а также факто ров, влияющих на процесс адгезии in vivo и in vitro , позволяет разработать профилактические меры, направленные на подав­ ление ранних этапов инфекционного процесса. В основе поисков антиадгезивных препаратов лежит созда­ ние эффективных препятствий с разнообразными механизмами действия при установлении взаимодействия между лигандами и рецепторами. Одним из наиболее известных механизмов, с учетом которого осуществляется подбор ингибиторов процессаадгезии, является введение в систему бактерии – эукариотиче ские клетки растворимых веществ, конкурирующих с лигандами или рецепторами за места связывания на клеточных поверхностях [9] . При этом все растворимые соединения можно разделить на две группы, способные реагировать либо с бактериальными, либо с эукариотическими клетками. Изби­ рательное связывание лигандов микроорганизмов предпочти­ тельнее, так как в меньшей степени влияет на рецепторный аппарат клеток-мишеней, а через него на самые разнообразные процессы в тканях макроорганизма [15].

К настоящему времени известны многочисленные экспери­ ментальные доказательства того, что применение природных или синтетических аналогов клеточных рецепторов и компонен тов тканевых жидкостей способно значительно снизить, а в от дельных случаях и полностью предотвратить прикрепление микроорганизмов к клеткам хозяина [9, 15, 16]. Установлены факты взаимодействия бактериальных лигандов с белками, гликопро теинами плазмы крови (иммуноглобулинами классов А и G , р2-микроглобулином, фибриногеном, фибронектином, альбуми­ ном, трансферрином, а также некоторыми другими [4, 16, 17] , мочи (ТН-белком) [18,19], слюны (муцином, агглютининами) [20], что позвол ило использовать большинство из перечисленных выше соеди нений в экспериментальных и клинических условиях в качестве ингибиторов бактериальной адгезии. Сегодня имеются данные об антиадгезивном действии экзогенных протеолитических ферментов. Действие ферментов не ограничивается изменением характера прилипания бактерий к мишени, но и приводит к нарушению уже сформированных колоний. Разные ферменты демонстрируют различный уровень эффективности.

Результаты аналитических исследований указывают на специфичность такого влияния. [21] Задачей настоящего исследования было оценить влияние зубной пасты, содержащей бромелаин на адгезию микроорганизмов, обитающих в полости рта человека.

 

Материалы и методы . Материалы: Исследована зубная паста .включающая бромелаин.
Контролем служила зубная паста аналогичной рецептуры без бромелаина.
Исследование проводилось слепым методом. Тестируемые образцы были обозначены условными номерами 56 ( R . O . C . S .) и 57 (контроль). Тест - культуры микроорганизмов : Клинические штаммы микроорганизмов , выделенные из ротовой полости волонтеров : Staphylococcus aureus 20, Streptococcus salivarius 67, Streptococcus sangius 12, Streptococcus sobrinius 83. Культура клеток: кожно-мышечных фибробластов эмбриона человека. Оборудование: бактериологические анализаторы – IEMS -фотометр фирмы LabSystems (Финляндия), BBL Crystal фирмы Becton Dickenson (США); система ввода изображений «Видео-ТЕСТ-морфология» (Германия). Методы. Микробиологические, морфологические.
Все исследования проводили в 3-х повторениях. 1- ый этап . Путем прямого посева тампоном из полости рта у 10 волонтеров на 5% кровяной агар получены чистые культуры микроорганизмов Staphylococcus aureus 20, Streptococcus salivarius 67, Streptococcus sangius 12, Streptococcus sobrinius 83.
Полученные штаммы были идентифицированы на вышеперечисленных бактериологических анализаторах. 2-ой этап. Изучена антиадгезивная активность тестируемых паст на культуре клеток (КК) кожно-мышечных фибробластов эмбриона человека. Фибробласты выращивали в пробирках Лейтона на покровных стеклах в ростовой питательной среде Игла 24 часа при 37 град. С до образования конфлюэнтного монослоя по методике Грабовской К.Б., Тотолян А.А., 1977 [22].
Затем ростовую среду сливали и добавляли по 1,8 мл тестируемых образцов паст и по 0,2 мл суточной культуры соответствующего тест-штамма в дозе 10 в восьмой степени КОЕ/мл и инкубировали 2 часа при 37 градю. С.
После инкубации клетки монослоя отмывают от неприкрепившихся бактерий многократной сменой среды Игла, фиксируют 96 этиловым спиртом, окрашивают по Романовскому-Гимза и исследуют микроскопически.
Опыты по оценке подавления адгезии тест-штаммов тестируемыми пастами проводили с разведением каждой пасты 1:20000 в присутствии 50% сыворотки человека.
Интенсивность процесса адгезии тест-штамма оценивали по следующим показателям: 1) индекс адгезии (ИА) выражают средним числом бактериальных клеток на одной эукариотической клетке; 2) процент пораженных клеток монослоя (ПК%); 3) обсемененность 100 клеток монослоя – микробную нагрузку (МН) – определяют по формуле МН= ИА х ПК%.
Степень адгезии микроба определяют по показателю микробной нагрузки относительно контроля, принимаемого за 100%.
В опыте использовали 2 экспозиции – 2 часа и 3 минуты с концентрацией 1:20000, практически не вызывающей повреждения монослоя клеток. (рис. 1, 2, 3, 4).
Как видно из таблицы 1, препараты 56 и 57 недостаточно интенсивно подавляли адгезию тест-микроорганизмов при экспозиции 2 часа - % подавления адгезии составил соответственно в отношении: - S . aureus – 28% и 16%;
- Str.salivarius – 30% и 17%;
- Str.sangius – 26% и 13%;
- Str.sobrinius – 31% и 17%.

Как видно из таблицы 2, при сокращении времени экспозиции до 3 минут эффективность препаратов 56 и 57 резко повышалась - % подавления адгезии составил соответственно в отношении: - S . aureus – 80% и 70%;
- Str.salivarius – 80% и 70%;
- Str.sangius – 83% и 72%;
- Str.sobrinius – 79% и 67%. Во всех случаях препарат 56 ( R . O . C . S . с бромелаином) был более эффективен, чем препарат 57. Заключение Эффективность препаратов для подавления адгезии нормальной микробиоты ротовой полости зависит от экспозиции: при 2-часовой экспозиции эффективность зубных паст невысокая, а при времени выдержки 3 минуты – она резко возрастает – до 70-80% подавления адгезии штаммов микроорганизмов. При этом 3 минуты – обычное время для чистки зубов. Это, по-видимому, связано с обратимостью адгезии в короткие сроки после внесения штаммов в модельную систему, т.к. обычно через 1-2 часа адгезия становится необратимой.
Полученные результаты свидетельствуют о перспективности разработки данных рецептур, особенно препарата 56 ( зубная паста . с бромелаином), как средств для профилактики формирования микробной биопленки в полости рта.

Таблица 1. Адгезивная активность тест-штаммов в присутствии тестируемых паст 56 («РОКС») и 57 (контроль) при экспозиции 2 часа Таблица 2. Адгезивная активность тест-штаммов в присутствии тестируемых паст 56 ( R . O . C . S ) и 57 (контроль) при экспозиции 3 минуты

Рис. 1. Контроль клеток

 

Рис. 2. Клетки + Str. Salivarius 67